Flüssigkeitschromatografie

Die Flüssigkeitschromatografie (liquid chromatography, LC) umfasst eine Reihe von Verfahren, zu denen Streng genommen auch die Dünnschicht- oder die Papierchromatografie gehören. Gemeinsam ist diesen Methoden, dass die mobile Phase (das Fließmittel) flüssig ist. Die Leistungsfähigkeit der chromatografischen Trennmethode und die Anwendungsbreite lässt sich um ein vielfaches erhöhen, wenn Feststoffe mit gutem Adsorbtionsvermögen (Zeolithe, Siliciumdioxid, Aluminiumoxid) als stationäre Phase genutzt werden. Diese Stoffe füllt man in ein langes, meist senkrecht stehendes Rohr, dass auch Säule genannt wird. Das zu trennende Gemisch wird oben auf die Säule gegeben und fließt mit der flüssigen mobilen Phase infolge der Schwerkraft oder angetrieben durch eine Pumpe durch die Säule.

In Abhängigkeit von der Art der zu analysierenden Stoffe und der dazu benutzten stationären Phase erfolgt die Trennung durch Adsorptions-, Verteilungs- oder Austauschprozesse, die auch durchaus gleichzeitig in einem System ablaufen können.

Je nach Säulendurchmesser, Teilchengröße der stationären Phase und Arbeitsdruck unterscheidet man zwischen der klassischen Flüssigkeitschromatografie (LC), und der modernen Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatografie (high performace liquid chromatography, HPLC).
Die klassische LC und die HPLC werden auch oft einfach als Säulenchromatografie bezeichnet.

Bei der HPLC ist die Teilchengröße der stationären Phase deutlich kleiner als bei der klassischen LC. Dadurch wird die zur Verfügung stehende Oberfläche der stationären Phase vergrößert und die Trennleistung der Säule entscheidend verbessert, sodass man mit der HPLC Stoffgemische trennen kann, bei denen die einfache LC versagt. Die kleineren Teilchen sind jedoch so dicht gepackt, dass die mobile Phase mit einer speziellen Pumpe durch die Säule gepumpt werden muss. Infolge dessen passiert die mobile Phase die HPLC-Säule schneller und die Analyse erfolgt in einer viel kürzeren Zeit als bei der klassischen LC.

Der benötigte hohe Druck der HPLC limitiert allerdings die Größe der verwendeten HPLC-Säulen. Mit der klassischen LC kann man in Abhängigkeit von der Größe der Säule und damit der Menge der stationären Phase Stoffgemische im präparativen Maßstab von einigen Gramm (bis ca. 10 g) trennen. Die HPLC wird im Allgemeinen hauptsächlich für analytische Zwecke eingesetzt. Mit der sogenannten "präparativen" HPLC können, unter Verwendung von größeren HPLC-Säulen und stärkeren Pumpen, Stoffgemische im präparativen Maßstab von bis zu 100 mg getrennt werden. Damit kann diese Form der HPLC dann nicht nur zur Analyse, sondern ebenso wie die LC auch zur Reinigung / Trennung von Substanzgemischen im chemischen Synthese-Laboratorium verwendet werden.

Die Aufgabe der flüssigen Probe erfolgt z. B. mit einer Spritze in den Injektor, wo sie von der mobilen Phase aufgenommen wird. Nach der Trennung in der Säule erreichen die einzelnen Substanzen nacheinander den Detektor, der die Zusammensetzung der mobilen Phase misst und so anzeigt, zu welchem Zeitpunkt ein Stoff die Säule verlassen hat. Für jede Komponente misst der Detektor ein Signal, das Peak genannt wird. Die Peaks werden in einem Chromatogramm dargestellt..

Der qualitative Nachweis wird über die Retentionszeit geführt, die sich aus der Verzögerung ergibt, mit der ein Analyt die Trennstrecke zwischen Injektor und Detektor passiert. Jede Komponente im Analytengemisch hat eine andere Retentionszeit. Sie ergibt sich aus den unterschiedlichen pysikalischen Eigenschaften der Substanzen, wie ihre z. B. ihre Polarität, und die dadurch bedingte unterschiedlich gute Adsobtion der Komponenten an die stationären Phase. Wie bei der Dünnschichtchromatografie arbeitet man mit Standards, um die Retentionszeiten für alle Komponenten zu ermitteln. Die Konzentration der Analyten wird aus der Fläche unter dem Peak berechnet. Je größer der Anteil der Komponente in der Probe, desto größer wird der Peak. Um die quantitative Bestimmung so genau wie möglich zu führen, kalibriert man die Methode mit Standards bekannter Zusammensetzung.

Auf diese Weise kann man speziell mit der HPLC eine sehr genaue und zuverlässige quantitative Analyse durchführen, die automatisierbar und für viele analytische Zwecke einsetzbar ist.
Mithilfe der HPLC können Spuren von Dioxinen in Bodenproben oder sogar in Lebensmitteln nachgewiesen werden. Die Konzentration von Dopingmitteln wie Erythropoietin (EPO) im Blut von Sportlern wird ebenfalls mittels HPLC bestimmt. Die Methode findet auch in der Arzneistoffanalytik viele Anwendungen.
So kann z. B. die Alterung von Aspirin® untersucht werden, indem man das Verhältnis von Acetylsalicylsäure und der Salicylsäure chromatografisch analysiert. Auch andere Verunreinigungen und Abbauprodukte des Präparats werden auf diese Weise zuverlässig nachgewiesen.