Chromatografie

Chromatografische Trennmethoden – ein Überblick

Bei der Chromatografie handelt es sich um ein physikalisches Trennverfahren für Stoffe, bei dem die Trennung auf der unterschiedlichen Verteilung zwischen einer stationären und einer mobilen Phase, die nicht miteinander mischbar sind, beruht.

Allen Arten der Chromatografie ist gemeinsam, dass das zu analysierende Stoffgemisch von einer beweglichen (mobilen) Phase, z. B. einem Lösungsmittel, aufgenommen und zu einer ruhenden (stationären) Phase transportiert wird. Aufgrund ihrer unterschiedlichen Wechselwirkungen mit der mobilen und der stationären Phase gehen die Komponenten entweder in die stationäre Phase über oder verbleiben in der mobilen Phase. Die Trennwirkung beruht auf Adsorptions-, Austausch- und Verteilungsvorgängen, die sich gegenseitig beeinflussen und den verschiedenen Stoffeigenschaften des Analyten.

Von Bedeutung für die Adsorbtion der einzelnen Komponenten des Analyten an der stationären Phase ist dabei besonders die Polarität der einzelnen Phasen und der zu analysierenden Stoffe. Ein polarer Analyt wird an einer polaren stationären Phase weitaus stärker gebunden als ein unpolarer Analyt. Also wird er die stationäre Phase später verlassen, als die unpolareren Bestandteile des Probengemisches. Polare stationäre Phasen enthalten besondere Strukturelemente wie OH-Gruppen, an denen sich polare Teilchen anlagern.

Das Chromatogramm (Bild 1) ist das Trennungsergebnis, das je nach Art der Chromatografie auf dem Papier, einer Dünnschicht-Platte oder in Form eines aus Messwerten erstellten Diagramms vorliegt.

Die wichtigsten chromatografischen Analysenmethoden sind:

  • Papierchromatografie
  • Dünnschichtchromatografie
  • klassische Säulenchromatografie (mit flüssiger mobiler Phase, Liquid Chromatography - LC)
  • HPLC (Hochleistungsflüssigkeitschromatografie bzw. High Performance Liquid Chromatography)
  • Gaschromatografie

Papierchromatografie
Bei diesem Trennverfahren dient spezielles Chromatografiepapier als stationäre Phase und Wasser, oft im Gemisch mit weiteren Flüssigkeiten als Fließmittel. Die angewandten Arbeitstechniken, z. B. Entwicklung der Chromatogramme, etc., ähneln sehr der Dünnschichtchromatografie. Diese hat die Papierchromatografie in chemischen Laboratorien fast vollständig verdrängt.

Ein Papier- Chromatogramm, bei dem die einzelnen Farbanteile eines schwarzen Farbstoffes durch eine Flüssigkeit unterschiedlich weit nach außen transportiert wurden.

Ein Papier- Chromatogramm, bei dem die einzelnen Farbanteile eines schwarzen Farbstoffes durch eine Flüssigkeit unterschiedlich weit nach außen transportiert wurden.

Dünnschichtchromatografie
Die Dünnschichtchromatografie ist ein chromatografisches Verfahren, bei der ein Lösungsmittelgemisch als Laufmittel (mobile Phase) über ein Sorptionsmittel (stationäre Phase) wandert und dabei die zu untersuchenden Stoffe und Gemische unterschiedlich gut transportiert und so voneinander trennt.
Die stationäre Phase ist eine dünne Schicht, z. B. Cellulose, Polyamid oder Kieselgel, die auf Glas-, Kunststoff oder Aluminium-Platten aufgebracht wurde.

Die zu untersuchenden Stoffgemische werden mithilfe von Kapillaren punktförmig auf einer Startlinie am Fuße der Chromatografie-Platte aufgetragen.

Das Laufmittel (mobile Phase) wird durch Kapillarkräfte entlang der dünnen stationären Phase transportiert. Dabei ist die Wanderungsgeschwindigkeit der gelösten Stoffe um so langsamer, je stärker die Adsorption an der stationären Phase ist

Im Ergebnis der Trennung erhält man auf der Dünnschichtplatte ein Chromatogramm mit mehreren Substanzflecken.
Die einzelnen Substanzen A und B lassen sich über den R f Wert identifizieren, wenn dieser mit einer Vergleichssubstanz übereinstimmt. Dieser Rückhaltefaktor oder Retentionsfaktor R f entspricht dem Verhältnis zwischen der Wanderungsstrecke der Substanz und der Wanderungsstrecke des Fließmittels. Er kann nur Werte zwischen 0 und 1 annehmen.

Da der R f Wert von über 20 Parametern beeinflusst wird, ist er als stoffspezifische Konstante ungeeignet. Deshalb müssen bei der Dünnschichtchromatografie immer Vergleichssubstanzen zur Identifizierung der Komponenten mit aufgetragen werden.
Die Trennung ist jedoch nur erfolgreich, wenn die R f Werte der zu trennenden Stoffe weit genug auseinanderliegen.

Die Dünnschichtchromatografie erlaubt die Trennung vieler Substanzgemische innerhalb kurzer Zeit mit einem geringen apparativen Aufwand. Mithilfe von UV-Licht, oder geeigneten Fluoreszenz- und Sprühreagenzien lassen sich der größte Teil organischer Verbindungen nicht nur trennen, sondern auch sichtbar machen. Sie wird jedoch selten zur quantitativen Analyse eingesetzt, weil die Bestimmung des Anteils der Komponenten A und B aus der Größe der Substanzflecken nicht sehr genau ist.

Säulenchromatografie
In der Säulenchromatografie ist die feste stationäre Phase in ein langes, meist senkrecht stehenden Rohr gefüllt, welches man Säule nennt. Das zu trennende Gemisch wird oben auf die Säule gegeben und fließt mit der flüssigen mobilen Phase infolge der Schwerkraft oder angetrieben durch eine Pumpe durch die Säule.

Je nach Säulendurchmesser, Teilchengröße der stationären Phase und Arbeitsdruck unterscheidet man zwischen der klassischen Säulenchromatografie und der modernen Hochleistungsflüssigkeitschromatografie.

Bei der HPLC ist die Teilchengröße der stationären Phase deutlich kleiner als bei der klassischen Säulenchromatografie. Dadurch wird die zur Verfügung stehende Oberfläche der stationären Phase vergrößert und die Trennleistung der Säule entscheidend verbessert. Auf diese Weise kann man mit der HPLC Stoffgemische trennen, bei denen die einfache Säulenchromatigrafie versagt. Die kleineren Teilchen sind jedoch so dicht gepackt, dass die mobile Phase mit einer speziellen Pumpe durch die Säule gepumpt werden muss. Dadurch passiert die mobile Phase die HPLC-Säule schneller und die Analyse erfolgt in einer kürzeren Zeit als bei der klassischen Säulenchromatografie (Bild 3).

Die Verzögerung, mit der ein Analyt die Trennstrecke zwischen Injektor und Detektor passiert, nennt man Retentionszeit. Wenn diese Zeit für alle Komponenten eines Stoffgemisches unterschiedlich ist, dann ist die Trennung erfolgreich. Aus der Fläche des chromatografischen Signals (engl.: Peak) lässt sich sogar die Konzetration der Stoffe im Gemisch ermitteln.

Mit der HPLC kann man eine sehr genaue und zuverlässige quantitative Analyse durchführen, die automatisierbar und für viele analytische Zwecke einsetzbar ist.
So können sogar Spuren von Dioxinen in Bodenproben oder in Lebensmitteln nachgewiesen werden. Die Konzentration von Dopingmitteln wie Erythropoietin (EPO) im Blut von Sportlern wird ebenfalls mittels HPLC bestimmt.
Die Methode findet auch in der Arzneistoffanalytik viele Anwendungen. Man untersucht z. B. die Alterung von Aspirin®, indem man das Verhältnis von Acetylsalicylsäure und der Salicylsäure chromatografisch analysiert.

Aufbau einer HPLC-Säulenchromatografie

Aufbau einer HPLC-Säulenchromatografie

Gaschromatografie
Die Gaschromatografie ist ein Trennverfahren für Stoffgemische, die gasförmig sind oder sich unzersetzt in die mobile Gasphase überführen lassen. Die Siedepunkte der zu analysierenden Stoffe sollten zwischen 40 und 300 °C liegen. Als stationäre Phase dient ein Feststoff oder eine flüssige Phase.

Die gaschromatografische Trennung beginnt mit dem Einspritzen der Probe in den Injektor. Flüssige Proben werden dort verdampft und vom Trägergasstrom durch eine Trennsäule transportiert. Die Trennung der Komponenten erfolgt hauptsächlich aufgrund ihrer unterschiedlichen Siedepunkte und gegebenenfalls ihrer Polarität.
Auf diese Weise getrennt, erreichen die einzelnen Substanzen nacheinander das Säulenende. Dort befindet sich ein Detektor, der z. B. durch Messung der Wärmeleitfähigkeit Änderungen der Zusammensetzung der mobilen Phase anzeigt und diese an eine Auswerteeinheit, in der Regel ein Computer, weitergibt (Bild 4). Aus der unterschiedlichen Retentionszeit der Komponenten ergibt sich ein Gaschromatogramm. Anhand der Fläche unterhalb der Peaks (siehe Abb.) kann man die Anteile der einzelnen Komponenten im Probengemisch ermitteln.

Bild

Man verwendet heute in Analyselaboren hauptsächlich leistungsfähige Kapillarsäulen für die Trennung der Gase. Kapillarsäulen sind 15 - 300 m lang und haben einen Innendurchmesser von nur 0,1 -1 mm. Sie sind innen mit einem sehr dünnen Film ( 0,1 5 μ m ) einer Trennflüssigkeit, z. B. Siliconöle oder Paraffine als stationäre Phase beschichtet. An solchen Säulen können sogar Isomere getrennt werden, deren Siedepunkte sehr dicht beieinanderliegen.

Mithilfe der Kapillar-GC können in der Umweltanalytik Gemische aus mehr als 20 verschiedenen aliphatischen oder aromatischen Kohlenwasserstoffen (z. B. PCBs, PAKs) getrennt werden.
Die Anwendungsbreite der Gaschromatografie reicht von der organischen Elementaranalyse bis zur Analyse des Blutalkoholgehalts. Auch Drogen wie Cannabis oder Kokain lassen sich noch lange Zeit nach ihrer Konsumierung gaschromatografisch nachweisen.

Prinzipieller Aufbau eines Gaschromatografen

Prinzipieller Aufbau eines Gaschromatografen

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